導(dǎo)讀

一種新型的基于 Trmt5 缺陷引發(fā)的具有自發(fā)性炎癥性腸病樣表型的斑馬魚模型

炎癥性腸病 (IBD) 是一種以胃腸道慢性炎癥為特征的復(fù)雜綜合征，研究者使用 CRISPR-Cas9 方法，基于 tRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 5 ( trmt5 ) 基因生成了能夠存活的trmt5 -/-斑馬魚作為一種新型斑馬魚 IBD 模型。

通過對trmt5 -/-斑馬魚與野生型斑馬魚（WT）進行對比發(fā)現(xiàn)：trmt5?/?的腸上皮減少，腸皺襞結(jié)構(gòu)消失，上皮扁平，細(xì)胞核定位紊亂，杯狀細(xì)胞減少（圖1a和圖1b）；腸上皮細(xì)胞中觀察到微絨毛被破壞和縮短，腸上皮細(xì)胞 (IEC) 的緊密連接和粘附連接有缺陷（圖1c）中腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少（圖1d）。

吞咽活性測定以及油紅O染色測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：trmt5?/?突變體中右旋糖酐-FITC   在10 dpf (減少60%)和16 dpf (減少90%)時顯著減少(圖 1e )。16 dpf時trmt5 -/-斑馬魚的前腸區(qū)發(fā)現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)ORO染色信號，表明腸道脂質(zhì)代謝中斷(圖1f)。這些數(shù)據(jù)表明：突變表型主要為后期發(fā)育缺陷，反映了trmt5對幼魚發(fā)育后期階段維持腸道功能的重要性。

a：斑馬魚內(nèi)臟在 5 dpf、10 dpf 和 16 dpf 時的代表性解剖圖；b：在不同時間點對應(yīng)于兩種基因型幼蟲的腸球或中腸的矢狀切片的代表性蘇木精-伊紅染色，紅色箭頭表示中腸中的杯狀細(xì)胞；c ：16 dpf 時trmt5 -/-和trmt5 +/+腸上皮細(xì)胞的 TEM 分析。trmt5 -/- IHC 表現(xiàn)出比野生型對照更短的微絨毛（紅色箭頭）；d：16 dpf 中腸矢狀切面的阿爾新藍(lán)染色；e：在 28.5 °C 下與 1% 葡聚糖-FITC 孵育 4 小時后斑馬魚消化器官的體內(nèi)成像；f：油紅 O (ORO) 染色用于 16 dpf 的中性脂質(zhì)積累，左圖為整片 ORO 染色，右圖為冷凍切片。圖a-f 

應(yīng)用 RNA 測序分析16 dpf 的trmt5 -/-斑馬魚與野生型斑馬魚，結(jié)果顯示trmt5 -/-斑馬魚：有 1211 個上調(diào)和 3679 個下調(diào)的不同表達(dá)基因（DEGs）（圖 1g)；腸道與 IBD 相關(guān)基因的失調(diào)（圖 1h）。在免疫應(yīng)答和細(xì)菌、病毒感染過程中，上調(diào)的DEGs顯著富集(圖1i）。通過中性粒細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系（Tg (mpx: EGFP)），以及qRT-PCR分析巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)，也證明了trmt5的缺失會導(dǎo)致幼魚后期腸中中性粒細(xì)胞的募集(圖1j)。

應(yīng)用 16s rDNA 擴增測序，結(jié)果顯示 trmt5 ?/?斑馬魚中：腸道微生物多樣性顯著降低（圖1k）；微生物群存在顯著差異（圖1l）；其腸道微生物組組成在類和科水平上都發(fā)生了變化(圖1m)。STAMP分析表明：trmt5 -/-突變體在γ-變形菌門中表現(xiàn)出相對豐度增加，而被稱為益生菌菌株和抑制炎癥的乳桿菌科的相對豐度降低?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明trmt5 -/-斑馬魚表現(xiàn)出IBD的一些標(biāo)志性特征，這更可能代表人類克羅恩病。

圖g-m

G：差異表達(dá)基因 (DEG) 的火山圖，紅色和藍(lán)色圖分別表示上調(diào)和下調(diào)的 DEG；h ：IBD 相關(guān) DEG熱圖；i：與trmt5 +/+相比，trmt5?/?中 29 個上調(diào)免疫相關(guān)基因的圓形熱圖； j：7 dpf、10 dpf 和 16 dpf的trmt5 ?/?和trmt5 +/+ Tg (mpx: EGFP)轉(zhuǎn)基因幼蟲的整體裝載。Tg (mpx: EGFP)是中性粒細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因系。清晰分散的綠點（由紅色箭頭表示）代表嗜中性粒細(xì)胞，而彌散的綠色信號（由黑色星號表示）是斑馬魚腹腔的背景噪音；k：trmt5 ?/?和trmt5 +/+腸道微生物群的阿爾法多樣性比較；P：表示顯著性 (** p ?< 0.01, *** p ?< 0.001)；l ：UniFrac主坐標(biāo)分析（PCoA）分析：m：trmt5 ?/?和trmt5 +/+家族水平的腸道微生物群的宏基因組分析。

在trmt5 -/-突變體的腸上皮細(xì)胞中觀察到異常和細(xì)長的線粒體形態(tài)（圖 1n），以及COX 和 SDH 的酶活性降低（圖1o）。這暗示了trmt5 ?/?腸中的 OXPHOS 缺乏。因此導(dǎo)致trmt5 -/-腸中 ATP 的產(chǎn)生減少和 ROS 的過量產(chǎn)生（圖 1p，1q）。此外，在trmt5?/?突變體中發(fā)現(xiàn)了線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(UPRmt)的激活，線粒體熱休克蛋白(Hsp60)在trmt5?/?斑馬魚中顯著上調(diào)，該蛋白驅(qū)動UPRmt，被認(rèn)為是IBD的重要驅(qū)動因素。這些數(shù)據(jù)表明：trmt5的缺失導(dǎo)致斑馬魚腸道線粒體功能障礙。這可能是自發(fā)發(fā)展的IBD-like表現(xiàn)型的原因。

圖n-r

n： 通過Tg（Xla.Eef1a：MLS-EGFP）轉(zhuǎn)基因幼蟲比較trmt5 ^-/-和trmt5 ^+/+在16 dpf 的線粒體形態(tài)，Tg (Xla.Eef1a: MLS-EGFP)表達(dá)線粒體靶向EGFP，細(xì)胞核與 DAPI（藍(lán)色）共染色；o：16 dpf 的腸 COX/SDH 染色；p：16 dpf 時的相對總 ATP 產(chǎn)量；q： 16 dpf 時通過 DCFH-DA 染色檢查 ROS 的產(chǎn)生；r：參與 UPR mt的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，包括 Hsp60、Afg3l2 和 Lonp1。

作者通過實驗還表明，乳桿菌GG (LGG)對trmt5^?/?幼魚有保護作用：緩解了IBD樣表型（圖1s）；顯著降低促炎基因lect2l的表達(dá)(圖1t), 明顯改善吞咽活動 (圖1u)，以及延長的中位生存期（圖1v）

圖s-v

s：實驗設(shè)計的示意圖，兩組斑馬魚在 16 dpf 時促炎基因的t mRNA 表達(dá)；u： FITC 標(biāo)記的葡聚糖在16 dpf 處檢測到吞咽活動；v：在trmt5 ^?/?斑馬魚中每天喂食LGG后，存活率顯著延長。

結(jié)論：本研究在斑馬魚中產(chǎn)生了第一個 Trmt5 缺陷脊椎動物系，該系具有自發(fā)發(fā)展的人類 IBD 病理特征。進一步的研究表明，通過類似于 IBD 治療策略能夠使該系表型得到部分緩解。因此建議trmt5 ^-/-斑馬魚可作為研究 IBD 發(fā)病機制的疾病模型，以及開發(fā)和評估潛在治療干預(yù)措施的平臺。

點評：炎癥性腸病在斑馬魚上具有傳統(tǒng)的研究歷史，除了基因缺陷能夠引起的相關(guān)疾病以外，常見的TNBS等一類藥物也能在斑馬魚上誘導(dǎo)相應(yīng)的模型。斑馬魚豐富的免疫細(xì)胞標(biāo)記品系，以及炎癥誘導(dǎo)效應(yīng)品系（Tg(nfκb:EGFP)）能夠為炎癥性腸病的發(fā)病機理研究提供強有力的支持。

文章作者：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士后趙瓊和博士研究生?；蹫楣餐谝蛔髡?，陳燁教授為論文通訊作者，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院趙春華教授和浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邵建忠教授為共同通訊作者。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41392-023-01318-6

因為專注，所以專業(yè)；

百維斯生物，鑄您成就

 - End  ▎bio-service.cn/

百維斯生物主要報道有關(guān)斑馬魚生物科技領(lǐng)域熱點資訊、解讀前沿進展、分享科研資料。我們組建了科研交流群，歡迎大家來交流，添加公眾號或下方二維碼。